王長年 趙俊娜：非瘟防控，豈容“烽火戲諸侯”？——淺談PCR實驗室環境污染的監控措施及規范化操作流程

發布日期：2020-01-22 21:24:32 來源：互聯網

編者按：

不以規矩，不能成方圓。實驗室環境污染的監控措施及規范化操作流程都是經過長期實踐、廣泛驗證的有效措施，我們只要高度重視、規范化操作就能大幅度降低管理中的風險。毫無疑問，實驗室的檢測、監測在防控非洲豬瘟方面起到了非常重要的作用！王長年、趙俊娜分享《非瘟防控，豈容“烽火戲諸侯”？——淺談PCR實驗室環境污染的監控措施及規范化操作流程》，推動實驗室標準化與規范化運行。

摘要

隨著非洲豬瘟（ASF）的來襲，國內熒光定量PCR實驗室如雨后春筍般地快速發展。熒光定量PCR方法已成為ASF防控過程中最常見的手段。我們通過調查發現：隨著檢測量的增加，各實驗室的環境污染問題日益突出。2019年初，仇華吉研究員多次在國內ASF防控會議上，從專家的角度呼吁大家在做ASF檢測和監測時，務必要防止實驗室本身所造成的污染問題。

自此，如何建立實驗室，如何防止實驗室的污染問題也逐漸引起了大家的關注和重視！我們通過與諸多實驗室共同地努力和不斷地優化，逐步建立了一套熒光定量PCR實驗室的環境污染監控和處理方法，分享給同行，供大家參考。

關鍵詞：PCR實驗室 環境污染 監控系統 SOP
 

熒光定量PCR技術在國內獸醫體系的大量應用，多半是為了防控非洲豬瘟（ASF）。所以很多實驗室都是為了應對ASF疫情而倉促上馬的，設計不合理、運行不規范，經常會出現實驗室污染問題；而這些問題往往未能得到足夠的重視，導致出現“陰性對照不成立、甚至出現假陽性”的錯誤結果。為有效地控制PCR實驗室污染，我們通過對實驗室的設計和布局、實驗室環境污染監控體系的建立以及相關問題的處置、人員的培訓等方面來提高PCR實驗室檢測水平。

01

PART

實驗室的設計和布局

1.1 關于PCR實驗室的設計和布局

PCR實驗室設計的科學與合理是保證實驗結果準確的必備條件。我們常見一些實驗室由于在設計上的缺陷，導致實驗室的環境污染難以去除，甚至不能再進行PCR檢測或不愿意使用高敏感的試劑盒來檢測（“鴕鳥策略”）！

標準化的 PCR 實驗室設計最主要考慮的兩個方面：

1、各區獨立

2、注意風向

PCR實驗室的分區我們按照污染程度來劃分：可分為試劑準備區-核酸提取區- PCR擴增區，普通的PCR實驗室還有產物分析區，其污染程度依次增大。PCR實驗室各個相對獨立的區域內要做好正負壓的控制，簡易的實驗室可以安裝不同數量的排風扇來實現不同區域的壓差。嚴格分區還要注意實驗室內的空氣在不同區域的流向問題。我們要防止擴增產物順空氣氣流進入上游擴增前的 “潔凈” 區域。所以，實驗室科學的通風設計在去除氣溶膠污染方面是非常有幫助的！

1.2 PCR實驗室的設計中常見的一些錯誤

我們參觀和了解過許多實驗室，發現有些PCR實驗室的設計存在嚴重的問題。下面是一些常見的設計錯誤，希望能夠引起大家的注意。

1) 中央空調互通：這樣就造成實驗室各區域的互通，非常容易造成整個實驗室的污染，進而不能使用。所以，需要在各區域另行安裝分體式空調或者安裝PCR實驗室專用的分區通風系統。

2) 隔斷不密封：有些實驗室在分區設計時，只是考慮實驗室在形式上的分區（各區分割不完全，有相通之處；各區之間無緩沖間；或者即便有緩沖間，卻在裝修時采用家庭裝修模式-吊軌式推拉門或者平開門，門的下面留有縫隙等等）。

3) 傳遞窗不密封：如果傳遞窗不密封，雖然有時方便了試劑、物品在不同實驗區間的傳遞，但同時也增加了交叉污染的風險。一個合格的傳遞窗應是雙開門且密封嚴實，并且兩邊的門最好設置連鎖裝置控制（即一次只能開啟一扇門）。此外，傳遞窗內應配有紫外燈照射裝置，并在每次使用后立即進行照射。

02

PART

實驗室環境污染的監控體系

建立以及相關問題的處置方法

2.1 PCR實驗室環境污染監控的重點

PCR實驗室環境污染監控和豬場環境監控的關注點是不一樣的。在實驗室層面，主要是關注產物和氣溶膠的核酸污染問題；而在豬場，則關注對病毒污染的監測。所以，我們對于PCR實驗室的監測關注點在重點區域和關鍵儀器設備方面。

下面是對PCR實驗室劃分的監測重點區域和關鍵的儀器耗材：

實驗區域：按區域采樣：試劑準備區、核酸提取區、 PCR 擴增區。采樣重點是在操作臺面和控制按鈕、冰箱門把手、離心機、槍頭盒蓋等。

儀器耗材：移液槍、離心機、渦旋振蕩器、核酸提取儀、PCR儀等。

2.2 PCR實驗室的環境采樣

實驗室環境采樣需要使用專用拭子（一般長度在10-15cm，易折斷為佳）。使用時將它浸入裝有350-500微升PCR級水的1.5ml離心管中，然后將拭子在離心管壁上適度擠壓，去除多余的水。注意：在不同區域采樣時需更換拭子。

1)將拭子在長約30cm的取樣區域旋轉擦拭2-3次（臺面或離心機內表面）。然后將拭子放回離心管，渦旋震蕩10-15秒，洗脫拭子上捕獲的核酸。

2)按上述方法去除拭子上的水，剩下液體作為檢測樣品。具體采樣檢測操作如下圖所示：
 

2.3 PCR實驗室氣溶膠污染的監控

氣溶膠污染的監控主要針對超凈工作臺和生物安全柜：可以采用空氣采樣方式。

1) 將6-8層紗布，其面積為30cm*30cm，用PCR級水或無核酸殘留的純凈水浸潤，打開風機，將其放在出風口5-10分鐘后取出。將紗布放在帶蓋的塑料離心管內，渦旋振蕩10-15秒，洗脫紗布上捕獲的核酸。

2) 或者，將裝有30-50微升PCR級水的1.5ml離心管，敞開蓋放置在不同的監測區域12-24小時采樣，然后進行檢測。

2.4 PCR實驗室環境監控頻率

我們可以根據實驗室不同的等級劃分和檢測樣本的情況，建議采取如下三種頻率進行：

1)一般實驗室監控頻率可以按照: 每周或每兩周監測1次進行。【基層實驗室】

2)檢測樣本非常頻繁，需要增加監控頻率：每周監控1-2次。【集團中心實驗室】

3)國家參考實驗室：要求每天必須進行實驗室環境監控。【專業參考實驗室】

2.5 PCR實驗室環境監控配套試劑

PCR實驗室環境污染的監控需要配備專門的配套檢測試劑。IDEXX可以提供各PCR實驗室環境監測所需要的相關產品，幫助大家更專業地評估和及時發現實驗室可能存在的污染問題。

1)IDEXX RealPCR™ ASFV DNA Mix

2)IDEXX RealPCR™ PC DNA Tracker

（陽性對照追蹤DNA檢測混合液）

3)IDEXX RealPCR™ Signal Check

（QC細菌DNA檢測混合液）

實驗室環境監控方案
 

* 根據具體實驗室檢測內容來確定

（ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……）

實驗室環境監控結果解讀
 

* 根據具體實驗室檢測內容來確定（ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……）

2.6 PCR實驗室環境污染處理措施

【方法一】將84消毒液配置成最終有效氯濃度為2000 mg/L的溶液，對重點污染區進行擦拭；孵育5分鐘后，用潔凈的紙巾擦拭干凈，再用清水或75%酒精進行兩遍清洗。

【方法二】使用商品化核酸清除試劑（如DNAZap、DNAOff或DNAAway）進行處理。使用時直接將商品化試劑噴涂于需要處理的區域，孵育5分鐘后用潔凈紙巾擦拭干凈后，再用清水或75%酒精進行兩遍清洗。同時建議配合房間的紫外燈和移動紫外燈（照射高度30-50 cm）對重點污染區、離心機、PCR儀等進行照射。建議消毒完后再進行各房間的通風。

2.7 PCR實驗室高風險污染區域的處理方法

移液槍：單按鈕移液槍：緩慢勻速移液。各區的移液槍要單獨使用且應有各自的標識；使用后，移液槍錐嘴處及表面用75%酒精溶液清潔。若使用過程中發生污染，應及時對移液槍咀使用75%酒精浸泡15分鐘左右。可考慮使用Eppendorf R-II移液槍（防止氣溶膠污染）。

離心機：每次實驗開始前，用75%的酒精擦拭離心機（外表、轉子及內壁）。每次實驗完畢后，先用84消毒液浸泡過的軟布擦洗離心機，再用潔凈的濕布擦洗，待干后蓋上機蓋。每月使用中性去污劑清潔轉子與離心室（打開離心機蓋，撥掉電源線，用專用設備將離心機轉子旋下）。

qPCR儀器：定期清潔熱蓋和反應槽。具體方法：關機后，將反應槽取出，打開熱蓋，用95%酒精或異丙醇浸透的棉棒擦拭反應孔（逐孔擦拭，污染嚴重時需逐孔更換擦拭所用的棉棒）和熱蓋，待酒精或異丙醇揮發后再將反應槽安裝好，將熱蓋恢復原位。若發生污染嚴重時則改用中性消毒液，按上述步驟消毒，然后再用95%酒精或異丙醇擦拭。

注意：實驗室環境監控出現污染并處理后，仍需要對處理后的效果進行二次評估，確定沒有污染后才可以進行實驗。

03

PART

PCR實驗室人員的培訓

PCR實驗室人員必需具有專業的素養，必需對實驗室檢測、監測方面非常清晰和了解，定期進行回顧和培訓。建立標準的SOP以及實驗室各種規章、制度等。

04

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PCR實驗室規范化操作流程

（趙俊娜）

建立PCR實驗室規范化操作流程（SOP）非常重要！我們只有建立了良好的PCR實驗操作規范，才能有效降低實驗室環境的污染的發生，使我們的檢測結果更為準確！

4.1 實驗前：準備工作

1)進不同區域要換不同的拖鞋、穿不同的工作服，戴上手套、口罩等。

2)每日檢測前開啟紫外燈和移動紫外燈：距離臺面30-50cm照射30-60分鐘。

3)開啟排風柜，保證檢測區域空氣單向流動。

4)試劑、耗材的準備：特別是在裝槍頭的時候必需戴一雙全新的手套。

5)標記好樣本。

4.2 實驗中：減少試劑、器具被污染的風險

1)樣品的處理：按照規程處理樣本；試劑在前，樣本在后。

2)最好使用帶濾芯的槍頭（防止氣溶膠的污染）。

3)開管蓋時需防止液體接觸到手套；操作全程注意防止液體的飛濺和灑出。

4)加樣順序：陰性對照、待檢樣本、陽性對照（不建議使用高濃度核酸或質粒作為陽性對照）。

5)保存數據，清理廢棄物。

4.3 實驗后：及時清理，保證環境潔凈

1)將吸頭、離心管、PCR產物等用消毒液浸泡處理。手套、口罩、鞋套丟棄于指定垃圾桶。若條件允許，則將廢棄物與樣品一同焚燒處理；或者與第三方合作處理。

2)用84消毒液（按照有效氯2000mg/L濃度，現配現用）擦拭移液槍、儀器（注意PCR儀等屬于精密儀器，不建議使用84消毒液）、臺面等，作用后再用清水擦拭干凈，紫外燈照射。

依次清潔各區的實驗臺面和地面。各區清潔消毒工具均為專用。注意按照單一方向流程的原則進行清潔。

結論

非瘟防控，實驗擔當！在非瘟防控過程中，實驗室的檢測、監測起到了非常重要的作用！我們通過PCR實驗室科學的設計和布局、關注通風和風向、定期進行環境污染的監控和處置，能大幅度降低PCR實驗室的污染，增加檢測結果的準確性，從而為實驗室人員樹立信心。同時，注意實驗室操作人員專業化的培訓以及PCR實驗室人員規范化的操作，對于獲取準確的實驗室結果也非常重要！

致謝：

●仇華吉研究員提供了非常寶貴的建議和意見！

●IDEXX同事：徐靈龍、李敏華、李昭春、宮大慶、崔保亮提供了非常好的素材和經驗分享！
 

專家點評

實驗室檢測結果的準確性事關豬只、豬場、豬場經營者的“生死抉擇”，而影響實驗結果的準確性中最重要的一環就是如何控制好實驗室的環境污染問題。本文作者深入淺出地將PCR實驗室的設計、實驗室環境污染的監控方法及處理建議以及規范化操作進行了詳細地描述和介紹，非常有助于各級PCR實驗室的參考和借鑒。

非洲豬瘟儼然上升為事關國計民生的 “大事”！中國非洲豬瘟防控逐步進入深水區-但目前所有的經驗、教訓、成功案例等都僅代表的是“階段性的”或“過去式的”成果，離根除非洲豬瘟的目標還有很長的路要走！所以，我們必需時時刻刻都要對非洲豬瘟懷有敬畏之心！我們希望在防控非洲豬瘟的戰役中，所有的實驗室的非洲豬瘟檢測和監測的結果都是準確的！

“幽王烽火戲諸侯”，導致國破家亡的悲劇！非瘟“烽火”已起，ASF檢測不可兒戲！我們也期待著業界同仁們從各自專業的角度為贏得這場戰役而出謀劃策！中國的抗擊非瘟的戰役將注定會成為中國歷史上最偉大的“戰役”之一！